Augustus指南(Trainning部分)

Augustus指南

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官方 Tutorial Index

Augustus是一个真核生物基因预测软件，目前有网页服务端和本地版，它基于Hidden-Markov Model（隐马尔科夫链模型HMM）（一个不错的HMM介绍博客）的预测方法，因此需要一个已经研究清楚的物种进行training(学习)之后再对新物种进行prediction（预测），用于trainning的物种应该和需要预测的物种具有较近的亲缘关系

特点：官方介绍

Input:

Trainning:

已知物种序列

核酸序列：fasta格式 ( genome.fa )
蛋白序列：fasta格式 ( proteins.aa )

Prediction

未知基因组序列

核酸序列：fasta格式 ( NewGenome.fa )

Output：

可能用到的其他软件

1. Scipio
   下载地址中下载Scipio Version 1.4，压缩包中包括perl文件和说明文件

   Scipio是利用蛋白序列标记出基因组结构的软件，提供 核酸序列和 蛋白序列后，它可以为你解析出基因的结构。它基于BLAT的序列比对功能。scipio可以很好地跨contigs比对。
   用途包括：

   1. 检测序列assembly的正确性
   2. 识别外显子区域，可变剪切
   3. 用已知物种蛋白序列描述未知物种的基因组结构

2. Scipio依赖：perl中的YAML module
   Ubuntu安装yaml-perl命令：

sudo apt-get install libyaml-perl

1. Scipio依赖：BLAT 下载地址，下载后的文件中有数个可执行文件，请添加进环境变量中，方便Scipio直接调用

   Blat，全称 The BLAST-Like Alignment Tool，可以称为"类BLAST 比对工具"，对于DNA序列，BLAT是用来设计寻找95%及以上相似至少40个碱基的序列。对于蛋白序列，BLAT是用来设计寻找80%及以上相似至少20个氨基酸的序列。速度快，共线性输出结果简单易读。Blat 把相关的呈共线性的比对结果连接成为更大的 比对结果，从中也可以很容易的找到 exons 和 introns。

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Trainning Augustus

重要提示：如果是第一次training，按照下面所述的步骤可以正常完成，但是如果效果不佳，官方介绍中有一些小经验，本文没有包含这部分内容

• Augustus基于Hidden-Markov Model（隐马尔科夫链模型）的预测方法，因此需要一个已经研究清楚的物种进行training(学习)之后再对新物种进行prediction（预测），用于trainning的物种应该和需要预测的物种具有较近的亲缘关系或者就是本物种。
• Trainning的实质是用已知的知识调整模型中的种种参数，因此一般已知的知识必须包含各种可能的情况。具体地说，在预测基因的模型中，用于training的数据就必须拥有是基因的序列以及不是基因的序列（基因间隔区，内含子等）。
• Trainning的数据会被分为两部分，一部分用于Trainning，另一部分用于检测调整参数后的模型。前者称为training set，后者称为test set。

作为用于training Augustus的已知信息，一般可以有以下几种：

1. 该物种已经存在的基因结构信息（比如：GenBank中的数据）
2. 该物种ESTs信息加上相对于的基因组信息（可使用PASA）
3. 该物种de novo组装的RNA-seq数据加上对应的基因组数据
4. 该物种已知的蛋白序列和对应的基因组数据
5. 近源物种的基因结构信息
6. 已经Trainning过的模型保存参数集后可以反复使用

1. 对于没有直接基因结构的情况，可以使用Scipio制作基因结构文件

如果已经有基因结构信息，且文件格式为Genbank格式的文件（*.gb）可以跳过此步。这种文件包含了：

1. 核酸序列
2. CDS编码区域的序列坐标信息
3. UTR信息

1.1 Run Scipio

scipio.1.4.pl --blat_output=prot.vs.genome.psl genome.fa proteins.aa > scipio.yaml # takes ~7m

scipio.yaml包含了每个蛋白alignment的细节，可用于下一步提取

• 输入的基因组5M，耗时约7min
• --blat_output=prot.vs.genome.psl的含义就是记录时间。
• genome.fa和proteins.aa为fasta格式。

1.2 Extract a GFF file，从scipio.yaml中提取GFF (General Feature Format) 基因结构文件

cat scipio.yaml | yaml2gff.1.4.pl > scipio.scipiogff
scipiogff2gff.pl --in=scipio.scipiogff --out=scipio.gff
cat scipio.yaml | yaml2log.1.4.pl > scipio.log     #产生log文件

scipio.gff文件是我们所希望得到的GFF文件，log文件可以帮助检测是否每个蛋白都得到标注。
scipio.gff长这样：

chr2R   Scipio  CDS     900562  900621  1.000   +       0       transcript_id "392"
chr2R   Scipio  CDS     904518  904880  1.000   +       0       transcript_id "392"
chr2R   Scipio  CDS     904940  905131  1.000   +       0       transcript_id "392"
chr2R   Scipio  CDS     905195  905263  1.000   +       0       transcript_id "392"
chr2R   Scipio  CDS     3595076 3596041 1.000   +       0       transcript_id "2517"
...

1.3 可选步骤 可视化基因结构（GBrowse）

GBrowse 下载并配置GBrowse，将GFF文件转化成GBrowse可读的文件。

1.4 将GFF文件转化成Genbank格式的文件

Augustus的etrainning学习软件需要输入Genbank格式的文件，这种文件包含了：

1. 核酸序列
2. CDS编码区域的序列坐标信息
3. UTR信息

由于大部分的基因结构信息都是GFF或GTF格式，Augustus提供了gff2gbSmallDNA.pl进行格式转化

gff2gbSmallDNA.pl scipio.gff genome.fa 1000 genes.raw.gb

整合gff文件和fasta文件，genes.raw.gb文件中将会有每个基因序列和其1000bp的上下游基因间隔序列。

1.5 去除不适合trainning的基因序列

genes.raw.gb文件已经符合Augustus的要求，但是其中可能包含：

1. 可变剪切的基因
2. 缺失启示密码子的基因
3. 缺失终止密码子的基因
4. 非正常的终止密码子（in-frame stop codons）

这些序列不适合用于软件的trainning，所以最好去除

etraining --species=generic --stopCodonExcludedFromCDS=true genes.raw.gb 2> train.err

得到问题序列文件train.err
--stopCodonExcludedFromCDS=true选项指将gb文件中的终止密码子视为cds中的一部分，这个选项需要视gb文件的来源而定，非scipio来源的文件可能需要设置为false
train.err长这样：

gene 186 transcr. 1 in sequence chr2R_549753-555284: Initial exon has length < 3!
gene 461 transcr. 1 in sequence chr2R_1034318-1036751: Initial Exon doesn't begin with start codon.
gene 567 transcr. 1 in sequence chr2R_1198437-1201521: Initial Exon doesn't begin with start codon.
gene 4537 transcr. 1 in sequence chr2R_1354359-1361857: Initial Exon doesn't begin with start codon.
gene 4783 transcr. 1 in sequence chr2R_1669860-1673241: Terminal exon doesn't end in stop codon. Variable stopCodonExcludedFromCDS set right?
gene 5161 transcr. 1 in sequence chr2R_2043765-2046183: Single exon gene doesn't begin with atg codon but with ccc
gene 6319 transcr. 1 in sequence chr2R_3734070-3735386: Initial Exon doesn't begin with start codon.
gene 3577 transcr. 1 in sequence chr2R_4767472-4770826: Initial Exon doesn't begin with start codon.

使用下面的命令来筛选掉这些问题序列：

cat train.err | perl -pe 's/.*in sequence (\S+): .*/$1/' > badgenes.lst
filterGenes.pl badgenes.lst genes.raw.gb > genes.gb
grep -c "LOCUS" genes.raw.gb genes.gb
# genes.raw.gb:594    原来序列有594个基因
# genes.gb:586           筛选后还剩586个

badgenes.lst为问题基因序列
genes.gb为没有问题的基因，依然是gb格式

2. 将用于Trainning的基因结构信息分为Trainning set和test set

随机的将genes.gb文件分为两个部分

randomSplit.pl genes.gb 100

该命令会生成genes.gb.test文件，它包含100条序列。
同时会生成genes.gb.trains文件，包含剩下的序列。

• 为了满足test的统计学意义，test set必须足够大（100-200 genes），才能起到检测作用。
• test set的选择必须满足随机，不能只是选择文件最前面100个或者最后面100个genes
• randomSplit.pl是Augustus中包含的软件

3. 为你的物种产生meta参数文件

• 模型中有两类参数：meta parameters 和 parameters（一般参数）。
• 前者包括拼接位点模型窗口的大小(the size of the window of the splice site models)、马尔科夫模型顺序(the order of the Markov model)等；
• 后者则是比如拼接位点模式的分布(the distribution of splice site patterns)、编码区非编码区k-mer概率(the k-mer probabilities of coding and noncoding regions)等。
• 一般来说meta parameters决定了parameters的算法，而且meta的数量比较少，而parameters则非常多。
• Training本质是调整模型中的parameters，但是不会改变meta parameters。

new_species.pl --species=bug

假设我们的物种叫bug
这条命令会在环境变量AUGUSTUS_CONFIG_PATH指定的位置建立一系列文件和文件夹
就像这样：

creating directory /home/mario/augustus/trunk/config/species/bug/ ...
creating /home/mario/augustus/trunk/config/species/bug/bug_parameters.cfg ...
creating /home/mario/augustus/trunk/config/species/bug/bug_weightmatrix.txt ...
creating /home/mario/augustus/trunk/config/species/bug/bug_metapars.cfg ...
...

bug_parameters.cfg文件包含了meta parameters和parameters，还包括一些对output文件输出的控制选项。

编辑bug_parameters.cfg文件，将stopCodonExcludedFromCDS选项改为ture

4. 第一次Training

4.1 Trainning

这里将进行第一次Training，training所使用的meta parameters是默认值。

etraining --species=bug genes.gb.train

这条命令将会在环境变量AUGUSTUS_CONFIG_PATH指定的位置$AUGUSTUS_CONFIG_PATH/species/bug建立或者更新一些文件，这些文件是exon, intron和intergenic region的parameter文件（training的结果文件）

ls -ort $AUGUSTUS_CONFIG_PATH/species/bug/

展示出与模型相关的各个参数保存文件，
其中：bug_{intron,exon,igenic}.pbl是新生成的文件

4.2 Testing

那么，我们现在就可以使用之前划分出来的test set来检测Trainning的效果
Test set的文件为genes.gb.train

augustus --species=bug genes.gb.test | tee firsttest.out # takes ~1m

• 这条命令对genes.gb.test中的所有核酸序列信息进行了预测，这里不会使用其中的结构信息的。
• 之后又将预测信息和gb文件给出的结构信息进行了比较，从而评价trainning的模型。
• 产生文件为firsttest.out*

grep -A 22 Evaluation firsttest.out

该命令展示了评价部分，输出这样的表格：

*******      Evaluation of gene prediction     *******

---------------------------------------------\
                 | sensitivity | specificity |
---------------------------------------------|
nucleotide level |       0.975 |        0.89 |
---------------------------------------------/

----------------------------------------------------------------------------------------------------------\
           |  #pred |  #anno |      |    FP = false pos. |    FN = false neg. |             |             |
           | total/ | total/ |   TP |--------------------|--------------------| sensitivity | specificity |
           | unique | unique |      | part | ovlp | wrng | part | ovlp | wrng |             |             |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------|
           |        |        |      |                115 |                 76 |             |             |
exon level |    511 |    472 |  396 | ------------------ | ------------------ |       0.839 |       0.775 |
           |    511 |    472 |      |   40 |    5 |   70 |   43 |    3 |   30 |             |             |
----------------------------------------------------------------------------------------------------------/

----------------------------------------------------------------------------\
transcript | #pred | #anno |   TP |   FP |   FN | sensitivity | specificity |
----------------------------------------------------------------------------|
gene level |   118 |   100 |   53 |   65 |   47 |        0.53 |       0.449 |
----------------------------------------------------------------------------/

表格中有三个子表格：

1. nucleotide level，sensitivity（预测到的百分率），specificity（其中正确的百分率）
2. exon level， #pred total/unique（预测得到unique外显子总数），#anno total/unique（实际unique外显子总数），TP（正确的预测），FP（假阳性），FN（假阴性）
3. gene level
4. 100个基因中，预测到53个
5. 83.9%的外显子被预测到
6. 77.5%的外显子预测成功

5. optimize_augustus.pl的优化

• 脚本optimize_augustus.pl可以通过不断迭代Tranning和Testing的过程，根据模型评价自动修改*_parameters.cfg文件中的meta parameters，使meta parameters的取值最优。
• 这个脚本的运行会非常费时间，而且最终的效果一般只能提高准确度几个百分点，慎重使用
• 在本例中Trainning基因组越5M，耗时越1d
  使用此脚本augustus和etraining命令必须在环境变量中

5.1 自动调整meta parameters

optimize_augustus.pl --species=bug genes.gb.train  # takes ~1d

本句命令最好加上nohup
命令完成后，meta parameters调整完毕。

5.2 retraining Augustus

meta parameters调整好后必须重新Trainning模型，否则没有任何意义。

etraining --species=bug genes.gb.train

同样你可以进行检验

augustus --species=bug genes.test.gb

• 如果此时你的gene level的sensitivity还是低于20%说明Trainning set不够大，请添加数据。

• 如果你获得了满意的Trainning结果，请开始prediction吧