用k-mer分析进行基因组调查：（二）用jellyfish进行k-mer频数统计
(全文约1520字)
【推荐】用Smudgeplot评估物种倍性后，用组合jellyfish+GenomeScope1.0做二倍体物种的基因组调查，用组合KMC+GenomeScope2.0做多倍体物种的基因组调查。
1. k-mer进行基因组调查的软件
k-mer进行基因组调查分为k-mer频数统计和基因组特征评估两步。
- jellyfish可以实现第一步k-mer频数统计。
- jellyfish的结果sample.histo可以用在GenomeScope上，实现第二步基因组特征评估。
2. jellyfish 简介
jellyfish是Center for Bioinformatics and Computational Biology在2011年研发的一款对DNA的k-mers计数的软件，用Hash表储存数据，能多线程运行。
3. jellyfish 安装
- conda安装
conda install -c bioconda jellyfish#安装的是v2.2.10
- github安装
- 在github：jellyfish上通过源码安装。
4. jellyfish 运行
一般先用jellyfish count进行k-mer计数，然后用jellyfish histo对结果进行统计，获得k-mer的频数分布直方表sample.histo。
4.1. count —— k-mer计数
- 命令
jellyfish count -m 17 -s 10G -t 12 -C -o sample.jf <(zcat sample_1.fq.gz) <(zcat sample_2.fq.gz)
- 参数
- sample_1.clean.fq sample_2.clean.fq
使用的PE reads，不支持压缩格式*.fq.gz输入文件，如果不解压缩，也可以用<(zcat sample_1.fq.gz) <(zcat sample_2.fq.gz)代替sample_1.fq sample_2.fq; 或者使用这种形式zcat *fq.gz | jellyfish count /dev/fd/0，其中/dev/fd/0是进程输入标志，代表管道前结果传递。
- -m 17
k-mer长度设置为17bp。如果基因组大小为G(单位是bp)，k-mer长度推荐设置成log(200*G)/log(4)。500Mbp的基因组对应约为17，1Gbp的19，10Gbp的21。 - -s 1000M
存储用的hash表大小为1000M，这个参数识别单位M(Mbp)和G(Gbp)。若该值不够大，则会生成多个hash文件，以数字区分文件名。最好设置的值大于总的独特的(distinct)k-mer数，这样生成的文件只有一个。如果基因组大小为G，每个reads有一个错误，总共有n条reads，则该值可以设置为[(G + n)/0.8]。
- -t 12
线程12 - -C
对DNA正负链都进行统计，表示考虑DNA正义与反义链，遇到反义kmer时，计入正义kmer频数中。如果是双端测序reads，需要这个参数。 - -o sample.jf
结果文件名为sample.jf，会生成k-mer计数文件sample.jf，是hash的二进制文件。
- c 7
k-mer的计数结果所占的最大比特数，默认支持的最大数字是2^7=128。该值最大，消耗内存越大。
- -out-counter-len=4
输出的二进制hash文件中的计数结果所占的字节数，一个字节是8比特，则默认支持的最大数字是2^32=4.3G。
- 不推荐用-Q，会将低质量的碱基替换成N。
- -L
不输出低于此值的k-mer
- -U
不输出高于此值的k-mer
- 输出
- sample.jf
hash格式储存的k-mer频数文件
4.2. histo —— 统计k-mer频率
- 命令
jellyfish histo -t 12 sample.jf > sample.histo
统计k-mer计数(sample.jf)得到k-mer频数分布直方表(sample.histo)。
- 参数
- -t 12
线程12。 - -l 1
x的最小值，默认是1。结果会将小于此值的所有的k-mer的数目作为(x‐1)的值总结到一行。
- -h 10000
x的最大值，默认是10000。结果会将大于此值的所有的k-mer的数目作为(x+1)的值总结到一行。 - -i 1
x轴取值间隔，每隔该数值取值，默认为1。
- 结果
- k-mer频数分布直方表(sample.histo)包含空格分隔的两列数据。
- 第一列代表k值出现的次数x(x=1,2,3…)，第二列是出现了x次的kmer的种类的数量y。
- sample.histo的两列即是kmer分布频率直方图的x和y轴的值。
4.3. merge 合并【按需选择】
如果jellyfish count模块输出结果的二进制hash文件有多个，需要将多个hash文件合并，合并到merge.jf。
jellyfish merge sample_hash1.jf sample_hash2.jf sample_hash3.jf -o merge.jf
4.4. stats 统计【可选】
jellyfish stats sample.jf -o counts_stats.txt
可以用stats模块来统计出k-mer总数（Total），特异的k-mer数目（Distinct），只出现过一次的k-mer数量（Unique），频数最高的k-mer数量（Max_count）等信息。
5. 基因组特征评估
获得k-mer频数分布表sample.histo后，推荐用GenomeScope1.0或者GenomeScope2.0或者GenomeScope的R脚本来做基因组特征评估和画图。也可直接用R绘制sample.histo的频率分布直方图/频率分布曲线。
5.1. GenomeScope 网页版
5.1.1. GenomeScope1.0 网页版 —— 适用于二倍体物种
- 在GenomeScope1.0 网页版上传前一步获得的k-mer频数分布表sample.histo文件。
- 设置参数k-mer length为第一步选择的k-mer长度值，这里是17；参数Read length为序列读长，一般为150；最后一个参数Max kmer coverage建议修改成更大的10000，以统计更多的k-mers。
- 结果显示预估的基因组大小，杂合度，重复率等信息。
5.1.2. GenomeScope2.0 网页版 —— 适用于多倍体物种
GenomeScope2.0 网页版也是类似的步骤。
5.2. R绘制
R绘制k-mer频数分布曲线初步查看基因组特征。
获得kmer_plot.png为频数分布曲线，可根据曲线峰值对基因组大小进行计算和预估。
#R 脚本示例
kmer <- read.table('sample.histo')
kmer <- subset(kmer, V1 >=5 & V1 <=500) #对频数范围5-500的数据进行绘制
Frequency <- kmer$V1
Number <- kmer$V2
png('kmer_plot.png')
plot(Frequency, Number, type = 'l', col = 'blue')
dev.off()
6. references
- jellyfish paper：https://academic.oup.com/bioinformatics/article/27/6/764/234905?login=true
- jellyfish github：https://github.com/gmarcais/Jellyfish
- jellyfish参数推荐：https://www.bilibili.com/read/cv16360242
- chenlianfu blog: jellyfish参数推荐：http://www.chenlianfu.com/?p=806